PG电子冻存原理

在细胞处于低于0°C的温度时，细胞会经历脱水现象，导致细胞内可溶性物质浓度上升，并可能形成冰晶。冰晶的尺寸对细胞的影响各异，大颗冰晶更容易造成细胞膜及细胞器的损伤和破裂。因此，复苏后的细胞存活率和状态通常与冻存前有显著差异。为了提高冻存细胞的存活率，我们会采取两个重要措施：首先，加入低温保护剂；其次，实施慢速冷冻。

PG电子冻存时机

理想的冻存时机为细胞生长良好，密度在80-90%之间，细胞数量一般在10^6-10^7/ml。活力差的细胞在冻存后成活率较低，因此需谨慎选择冻存时机。

PG电子低温保护剂

常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO）。作为一种渗透保护剂，DMSO能够迅速进入细胞，增强细胞膜的水通透性，降低冰点，并延缓冻结过程。这一过程中，细胞内的水分能够在冻结前向胞外转移，在胞外形成冰晶，从而减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤。

PG电子慢冻细胞

细胞的慢速冷冻可通过程序性降温盒实现，这样可以避免细胞内产生大的冰晶。如果没有程序降温盒，可以将冻存细胞依次放置在4°C 1小时、-20°C 2小时，再转至-80°C过夜。大多数细胞在这种条件下也能适应。

PG电子冻存液配置

冻存液应提前配置并置于室温下待用，以防止临时配置所产生的热量对细胞造成损伤（DMSO与培养基混合时会放热）。常规的冻存液配比为培养基：血清：DMSO = 7:2:1。如果细胞较珍贵，则可调整为血清：DMSO = 9:1。

PG电子操作步骤

1. 使用移液器吸干原培养基，加入适量的PBS，洗涤1-2遍。

2. 进行细胞消化：加入适量的胰酶，置于37°C培养箱消化（在10厘米大皿中加入1ml的0.25%胰酶，消化4-5分钟。注意，不同细胞的消化时间可能不同，终止消化的标准是当镜下观察到80%-90%的细胞开始变圆时）。

3. 消化到位后，加入胰酶2倍体积的完全培养基以终止消化，之后以800-1000rpm离心3-5分钟。

4. 准备好冻存管，标记上日期、细胞类别、操作者姓名及代数。待细胞离心后，去除上清液，加入冻存液重悬，每管约1-1.5ml，然后转移到冻存管中。

5. 将冻存管放入程序降温盒中，置于-80°C过夜，随后转移到液氮中保存。

PG电子注意事项

1. 细胞加入冻存液后需立即放入-80°C保存，不应在常温下放置过久。

2. 冻存细胞在-80°C中储存一般不建议超过半年，而在液氮中则通常不建议超过2年。