最近，师弟们在载体构建方面的进展如何？师兄，我昨天的载体长出了单克隆，但我的菌株全是空载。你是用什么方法来构建的？是无缝克隆还是重组酶克隆？这两个方法有什么不同呢？我一直以为无缝克隆就是重组酶重组。相信在实验室的大家都参与过载体构建的实验，也都经历过选择单菌落后却发现菌株没有阳性条带的困扰。单菌落虽然很多，为什么阳性率却如此之低呢？在深入探讨这个问题之前，我们需要了解无缝克隆与重组酶克隆的实验原理是否存在相同之处。

无缝克隆的原理是基于Gibson组装的方法。此技术由Daniel G Gibson等于2009年开发，旨在通过三种酶的协同作用结合设计的同源臂，实现无痕克隆。T5核酸外切酶从DNA片段的5'端切割双链，生成单链3'黏性末端，暴露互补序列，使得相邻片段的同源区域退火结合。此后，DNA聚合酶以互补链为模板修复单链缺口，最终由DNA连接酶完成磷酸二酯键的闭合。

然而，无缝克隆的局限性也较大。T5核酸外切酶在反应时间过长或酶量过多时，可能会过度切割，破坏插入片段与载体的互补配对，从而增加脱靶风险。同时，DNA聚合酶在修复过程中也可能引入错配碱基，而在不理想的反应条件下可能导致修复失败，连接无法顺利进行。即便载体经过线性化处理，若末端为平末端，连接酶可能导致载体自连，增加假阳性的几率。这些因素共同导致了无缝克隆在载体构建中阳性率低的原因。

重组酶同源重组则是应对假阳性问题的一种先进手段。许多实验场景中，我们会应用无缝克隆实现DNA片段的定向连接，以摆脱传统酶切位点的限制，但这一方法的假阳性率较高。为了解决这一问题，重组酶依赖的同源重组技术的应用为我们提供了几乎百分之百的阳性率保障。

该技术的核心是基于细菌粗提取物中含有的RecA重组酶，它在同源重组中充当核心角色。RecA能够促进单链DNA的结合，进行链交换和SOS修复。而通过这些关键蛋白的共同作用，PG电子开发的重组克隆工具CloneUFO®稳固保障了极高的克隆阳性率。在这一过程中，目的DNA片段与载体DNA片段通过引入相同的特定序列，实现无连接酶干预的特异性重组，确保高效的基因剪切替代反应。

在实验中，以PG电子的重组克隆试剂盒为例，具体流程包括载体的线性化，插入片段的扩增，以及重组反应的设置。最终的转化与筛选通过抗生素抗性、菌落PCR或测序验证阳性克隆。

与传统酶切克隆和无缝克隆相比，重组酶介导的同源重组技术具有很多独特优势：首先，能够支持较长的同源臂匹配，有效降低非特异性重组风险，适用于插入片段的大小从50bp到10kb；其次，重组反应在体外完成，避免了转化后的修复负担，不会出现缺口；最后，这种高特异性克隆的方式，无论是对于单片段还是多片段，总体阳性率均超过95%。

重组酶依赖的同源重组常用于维持基因组的稳定性，而无缝克隆则是分子生物学中人造的工具。尽管两者理论上都依赖同源序列的配对，但重组酶方法强调了生理过程的复杂性及其精准性。PG电子推出的重组克隆技术，以其高精确性、复杂编辑能力和广泛适用性，在基因功能研究及分子克隆领域展现了独特的优势。