3T3-L1脂肪细胞诱导分化实验方案

3T3-L1细胞是一种来源于小鼠胚胎成纤维细胞的细胞系，具有良好的前脂肪细胞向脂肪样细胞分化的能力。自1974年由Green和Kehinde首次分离以来，3T3-L1细胞已成为研究脂肪细胞分化及代谢，尤其是在研究肥胖和糖尿病等代谢性疾病机制中的重要工具。

为了有效检测诱导分化的效果，常用油红O染色法，这是一种经典的方法，可以直观评估细胞脂肪化程度。油红O是一种脂溶性染料，可特异性结合细胞内中性脂质，从而形成显著的红色脂滴。显微镜下观察到脂滴数量和大小的增加，通常意味着诱导分化成功。此外，通过检测特定的分子标志物，如PPARγ、aP2和LPL等基因和蛋白的表达，可以进一步评估细胞分化程度。

以下是通过六孔板对3T3-L1细胞进行脂肪样细胞分化的实验步骤：

第一阶段：细胞培养

1. 在每平方厘米3×10³个细胞的密度下，将细胞接种于六孔板中。注意：
   • 建议使用早代次细胞，以确保分化效果。
   • 铺板时需均匀，避免分化不均和细胞漂浮。
2. 在DMEM培养基中培养细胞至70%汇合度，每2-3天更换一次培养基。3T3-L1细胞通常在高糖的DMEM中培养，并添加10%的小牛血清或胎牛血清以促进生长，细胞在37℃、5% CO₂的条件下生长至95%汇合度即可进行分化诱导。
3. 分化前，汇合度不应超过70%，以减少细胞死亡风险。

第二阶段：分化诱导培养基的制备

培养基的制备需在无菌条件下进行。MDI（包含IBMX、地塞米松和胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基需新鲜制备。

1. 制备储备溶液：在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如使用冻干胰岛素，需根据说明书进行复溶。
2. 配置100 mL MDI诱导分化培养基：
• DMEM 100 mL
• IBMX 1 mL（终浓度5 mM）
• 地塞米松 100 μL（终浓度1 μM）
• 胰岛素 10 μg/mL
3. 配置胰岛素培养基，将胰岛素加入DMEM中至终浓度为10 μg/mL。

第三阶段：细胞分化

1. 从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，并每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基，记录为第0天。
2. 注意：在添加诱导剂时，应轻柔操作，尽量沿着侧壁添加，以减少对细胞的冲击。诱导培养基需预热至37℃以减少细胞刺激。
3. 第3天，移除MDI诱导培养基，替换为2-3 mL胰岛素培养基。
4. 第6天，去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。
5. 通常在第7-10天，可获得完全分化的脂肪样细胞。
6. 分化效果可通过油红O染色法检测，监测脂质积累，或通过检测脂肪细胞标志物的表达如脂联素和FABP4进行追踪。

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