## 培养说明书

### 一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性、贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：基础培养基为1:1的MCDB105（含最终浓度15g/L碳酸氢钠）与M199（含最终浓度22g/L碳酸氢钠）的混合液，搭配优质胎牛血清15%及双抗1%。

传代方法：首次建议进行1:2的传代操作。传代间隔需每两天更换培养液。

备注：使用无菌离心管收集培养基，留作对比及过渡培养。如果对比效果不佳，建议直接使用我们的PG电子完全培养基。

### 二、细胞处理步骤

收到细胞后，待其达到良好状态后，应将培养液注满并封闭瓶口，这样是运输细胞的最佳方式。在处理细胞前，用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，随后放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍照留存（建议拍摄40x、100x、200x下各一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，若未提供照片则默认为收到的细胞状态良好。传代后，建议一瓶使用原瓶完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基，以便进行对比培养，并在更换培养液后将瓶盖轻微拧松。

### 三、细胞培养步骤

a、细胞传代：如果细胞汇合度不到80%，则将瓶内完全培养液收集至离心管中，并保留5ml完全培养基放入37℃、5% CO2的培养箱中培养；若细胞密度超过80%，则可以进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。

2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后观察细胞状态。如果细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶并加入超过5ml的完全培养基以终止消化。

3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基重悬。

4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两瓶T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存：1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，倒置观察，待细胞收缩并变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟；

3. 弃去上清，加入1ml 的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中；

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如果后期要转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中保存24小时以上后再进行转移。

### 四、细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管（请注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴解冻，直至冻存管内无晶体。接着用75%的酒精擦拭冻存管外壁；将冻存管内的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟；弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

注意事项：一些细胞可能在运输过程中因贴附不牢而发生脱落，这是正常现象。如脱落数量较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，使用收集的上清进行过渡培养（后期可用于对比培养），然后沉淀并加入胰酶在细胞培养箱中培养。

### 五、售后条款

1）细胞出现问题的重发条件：对于运输过程中出现的细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，均可申请重发；细胞污染问题需在收到产品48小时内提供真实实验结果，核实后可重发；常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片）也可重发；若干冰冻存发货的细胞在复苏后或常温发货的细胞在静置4小时后出现污染，可重发；细胞活性问题需在7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后可重发；收到细胞的当天及第2、3天拍照，若3天内未告知问题，则视为产品合格。

2）细胞出现问题不予重发的情况：因客户原因造成的细胞污染、客户操作不当导致的细胞状态不佳、非本库推荐培养体系导致的细胞问题，以及未提供细胞培养前3天照片，均不予重发。

如需了解更多细节或使用我们的PG电子细胞培养液，请随时联系我们。